Hans-Dieter-Belitz-Institut für Mehl- und Eiweißforschung

Kleberforschung

Zur Aufklärung der funktionellen Eigenschaften der Kleberproteine verschiedener Gereidearten werden oder wurden am Hans-Dieter-Belitz-Institut für Getreideforschung verschiedene Themen bearbeitet, von denen hier folgende beispielhaft dargestellt sind:

1. Quantifizierung und Lokalisierung proteingebundener Thiolgruppen in Weizenmehl

2. Disulfidbindungen in Weizenkleber

1. Quantifizierung und Lokalisierung proteingebundener Thiolgruppen in Weizenmehl^a [Seitenanfang]

Susanne Antes und Herbert Wieser

Ausgangslage: Etwa 5% des Gesamtcysteins in Weizenmehl liegen in der Thiol (SH)-Form vor; davon entfallen ca. 0,5% auf niedermolekulare Thiolverbindungen wie Glutathion und Cystein und ca. 4,5% auf proteingebundenes Cystein. Die Thiolgehalte in Mehl wurden bisher mit amperometrischen oder polarographischen Methoden bestimmt; die Werte lagen in einer Größenordnung von 1 µmol/g Mehl. Colorimetrische Methoden, z.B. nach Ellman, wurden aufgrund der schlechten Löslichkeit der meisten Mehlproteine bisher nicht angewandt. Unter Stickstoff vermahlene und gelagerte Mehle zeigen höhere Thiolgehalte, was sich auch in den rheologischen Eigenschaften (erhöhte Dehnbarkeit, verringerter Dehnwiderstand) widerspiegelt. Über die Verteilung proteingebundener Thiolgruppen auf die Osborne-Fraktionen sowie auf einzelne Kleberproteintypen und über ihre Positionen innerhalb der Proteinstrukturen ist nur wenig bekannt.

Forschungsziel: Die mit geringem Aufwand und guter Reproduzierbarkeit verbundene Ellman-Methode soll soweit optimiert werden, daß sie für die Thiolbestimmung in Weizenmehl angewendet werden kann. Damit wird der Einfluß von Luftsauerstoff auf den Thiolgehalt in Mehl und dessen Bedeutung für die rheologischen Teig- und Klebereigenschaften studiert. Zudem soll eine Methode zur Lokalisierung freier Thiolgruppen mittels Fluoreszenzmarkierung entwickelt werden.

Ergebnis: Die Gesamtthiolbestimmung in Mehl mit Ellman's Reagenz hängt stark von der Art der Extraktion und dem Extraktionsmittel ab. Aufgrund der leicht gelblichen Färbung der Mehlextrakte, die die Farbmessung verfälschen würden, wurde gegen einen Leerwert gemessen, der die gleiche Menge Mehl enthält, jedoch nicht mit Ellman's Reagenz umgesetzt wurde. Mit dieser optimierten Methode konnte mit einem SDS-haltigen Puffer ein Thiolgehalt von 1,21 µmol Cystein/g Mehl erhalten werden. Eine enzymatische Hydrolyse steigerte die Zugänglichkeit der Thiolgruppen nicht.

Mehle, die unter Stickstoff vermahlen wurden (REK-N₂) zeigen höhere Gehalte an freien Thiolen als Mehle, die unter Sauerstoff vermahlen wurden (REK-O₂). Bezüglich der rheologischen Eigenschaften zeigen sowohl Teig wie auch Kleber, die unter Stickstoff bereitet wurden, einen geringeren Dehnwiderstand (DW) und eine erhöhte Dehnbarkeit (DB) gegenüber Teig und Kleber, die unter Sauerstoff bereitet wurden. Wird REK-N₂ unter Sauerstoff angeteigt, zeigt der erhaltene Teig im Zugversuch einen DW, der zwischen dem reinen Sauerstoff- und dem reinen Stickstoffansatz liegt. Wird Kleber aus REK-N₂ unter Sauerstoff gewonnen, so entspricht er in DW und DB dem reinen Sauerstoffansatz.


Positionen freier Thiolgruppen in Kleberproteinen des Weizens nach Fluoreszenzmarkierung

Um die proteingebundenen Thiolgruppen in Weizenmehl zu lokalisieren, wurde Mehl der Sorte Rektor (REK) in Anlehnung an die Osborne-Fraktionierung unter Ausschluß von Luftsauerstoff mit Wasser, Salzlösung und 60% Ethanol extrahiert. Der verbliebene Rückstand wurde dann mit einer SDS-Lösung in einen löslichen und unlöslichen Anteil fraktioniert. Die erhaltenen Extrakte wurden mit einem Fluoreszenzreagenz (DACM) umgesetzt. Fluoreszenzmessungen zeigten, daß 60% der markierten Cysteinreste in den SDS-löslichen Gluteninen zu finden waren. Untersuchungen über RP-HPLC ergaben, daß die freien Thiolgruppen in drei verschiedenen Kleberproteintypen, den LMW-Untereinheiten des s-Typs (Cysteinrest: C^x), den Gliadinen des α-Typs (Cysteinrest: C^z) und den Gliadinen des γ-Typs (Cysteinreste: C^b, C^c und C^z) enthalten sind.

Publikationen:
Antes S, Wieser H (2000) Untersuchungen über den Thiolgehalt in Weizenmehl. Lebensmittelchemie 54: 107
Antes S, Wieser H (2000) Quantifizierung und Lokalisierung proteingebundener Thiolgruppen in Weizenmehl. Getreide Mehl Brot 54: 290-294
Antes S, Wieser H (2000) Quantitative determination and localisation of thiol groups in wheat flour. In: Wheat Gluten. Proceedings of the 7th International Workshop on Gluten Proteins (Shewry PR, Tatham AS, eds) Royal Society of Chemistry, Campridge, pp 211-214

^a Gefördert von der Europäischen Union (FAIR CT-97-3010)

2. Disulfidbindungen in Weizenkleber^b [Seitenanfang]

Peter Köhler, Bettina Keck, Silvia Müller und Herbert Wieser

Ausgangslage: Aus Weizenmehl entsteht nach Zugabe von Wasser ein zähfließender und gleichzeitig elastischer Teig, der sich besonders gut zum Backen eignet. Für diese Eigenschaft ist der Kleber mitverantwortlich, der zu 90 % aus Proteinen besteht. Die wichtigsten Kleberproteine sind die hochmolekularen Glutenine, die für die Elastizität und die niedermolekularen Gliadine, die für die Viskosität der Teige verantwortlich gemacht werden. Von den Kleberproteinen sind die Kleberproteinkomponenten zu unterscheiden, die als Bausteine der Kleberproteine anzusehen sind. Sie lassen sich zu den 5 Gruppen hochmolekulare (HMW-) und niedermolekulare (LMW-) Untereinheiten von Glutenin, ω-, α- und γ-Gliadine zusammenfassen. Die HMW- und LMW-Untereinheiten bilden zusammen mit einem Teil der ω-Gliadine das Glutenin, das Gliadin enthält α, γ und ω-Gliadine. Während die Aminosäuresequenzen der Komponenten größtenteils bekannt sind, liegt nur wenig Information über die Bindungen vor, die bei der Bildung der Kleberproteine aus den Komponenten von Bedeutung sind.

Forschungsziel: Die Standardpositionen der Cysteinreste in Abhängigkeit vom Proteintyp sind bekannt. Im Kleber sind 95 % der Cysteinreste über Disulfidbindungen verknüpft. Experimentelle Beweise für die Art und die Position der Bindungen im Kleber liegen bisher nur wenige vor. Das Ziel des Projektes war der Nachweis von Disulfidbindungen in Kleberproteinen. Dazu sollten cystinhaltige Peptide in enzymatischen Hydrolysaten von Kleberproteinen zunächst identifiziert, dann isoliert und in ihrer Struktur aufgeklärt werden. Die Cystinpeptide sollten bekannten Aminosäuresequenzen von Kleberproteinkomponenten zugeordnet werden und so Einblick in die Verknüpfung von Cysteinresten im Kleber geben.


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Standardpositionen der Cysteinreste		Disulfidbindungen der Gliadine		Disulfidbindungen der Glutenine

Ergebnis: Zur Aufklärung der Disulfidbindungen im Kleber wurden zwei Ausgangsmaterialien verwendet: Gliadin und Glutenin. Dazu wurde Mehl der Sorte 'Rektor' angeteigt und der Kleber mit Wasser ausgewaschen. Mit 70 %igem wässrigen Ethanol wurde das Gliadin extrahiert, Glutenin verblieb als Rückstand. Das Gliadin wurde zunächst durch RP-HPLC in einzelne Komponenten aufgetrennt. Einzelne Gliadine wurden dann mit dem Enzym Thermolysin gespalten. Cystinpeptide wurden mittels differentieller RP-HPLC detektiert und isoliert. Die nach Reduktion der Cystinpeptide entstandenen Cysteinpeptide wurden mit 4-Vinylpyridin alkyliert, über RP-HPLC getrennt und mittels Edman-Abbau sequenziert. Das Glutenin wurde zur Entfernung niedermolekularer Anteile mit verdünnter Essigsäure (0,1 mol/L) extrahiert, mit Trypsin und Thermolysin hydrolysiert und mittels Gelchromatographie an Sephadex G25 nach Molekülgröße vorgetrennt. Die Isolierung und Charakterisierung der Peptide wurde wie bei den Gliadinen durchgeführt. Die Aminosäuresequenzen wurden bekannten Sequenzen von Kleberproteinkomponenten zugeordnet.

Anhand der Ergebnisse wurden zweidimensionale Modelle für die Disulfidbindungen in Kleberproteinen postuliert. Den drei Proteintypen der niedermolekularen Gruppe &alpha-; und γ-Gliadine, LMW-Untereinheiten von Glutenin) ist die Verknüpfung C^c/C^f1C^f2/C^y gemeinsam, was einer Disulfidschleife innerhalb der Domäne III und einer zweiten Schleife zwischen den Domänen III und V entspricht. α- und γ-Gliadine besitzen eine weitere Disulfidschleife C^w/C^z, die die Domänen III und V verbindet. γ-Gliadine und LMW-Untereinheiten werden durch eine zusäzliche Schleife zwischen C^d und C^e in Domäne III stabilisiert. Ein Teil der γ-Gliadine wurde im Glutenin gefunden. Verantwortlich dafür ist C^b*, das intermolekulare Disulfidbindungen ausbildet. Dieser nur in einem kleinen Teil der γ-Gliadine enthaltene neunte Cysteinrest kann bei der Kleberbildung zu einem Kettenabbruch bei der Polymerisation führen. Dies kann auch für einen kleinen Teil der α-Gliadine mit einer ungeraden Zahl an Cysteinresten angenommen werden.

Der Cysteinrest C^a in LMW-Untereinheiten stellt keine Standardposition dar. Im Gegensatz dazu scheint C^b* häufiger vorzukommen. C^b* ist, ebenso wie C^x in der Lage intermolekulare Disulfidbindungen auszubilden. C^x aus LMW-Untereinheiten kann Disulfidbindungen eingehen mit C^b* aus LMW-Untereinheiten, mit C^b* aus γ-Gliadinen und mit C^y aus HMW-Untereinheiten. C^x und C^b* sind verantwortlich für das Aggregationsvermögen von LMW-Untereinheiten. Bei der Kleberbildung können sie zur Kettenverlängerung der Aggregate beitragen.

Für die HMW-Untereinheiten wurden Disulfidbindungen nur für C^a/C^b im x-Typ und C^f1C^f2 im y-Typ nachgewiesen. Außerdem ist an C^y des y-Typs eine LMW-Untereinheit gebunden. Bei diesen Proteinkomponenten sind weitere Untersuchungen erforderlich. Insbesondere die Bindungen mit C^d und C^z sind von großem Interesse, weil sie eine wichtige Rolle für das Polymerisationsverhalten von HMW-Untereinheiten spielen könnten.

Aufgrund der bisherigen Ergebnisse kann angenommen werden, dass im Kleber keine zufällig verteilten intramolekularen Disulfidbindungen vorliegen, sondern dass ihre Bildung streng gerichtet erfolgt. Das Aggregationsvermögen der LMW-Untereinheiten ist überwiegend auf die Präsenz der Cysteinreste C^x und C^b* zurückzuführen. Diese Reste sind zur Ausbildung intermolekularer Disulfidbindungen befähigt und fehlen in der Regel bei den monomeren α- und γ-Gliadinen.

Publikationen:
Köhler P, Belitz H-D, Wieser H (1991) Disulphide bonds in wheat gluten: isolation of a cystine peptide from glutenin. Z Lebensm Unters Forsch 192:234-239
Köhler P, Belitz H-D, Wieser H (1992) Disulphide bonds in wheat paste. Veroeff Arbeitsgem Getreideforsch 242:7-20
Köhler P, Belitz H-D, Wieser H (1993) Disulphide bonds in wheat gluten: further cystine peptides from high molecular weight (HMW) and low molecular weight (LMW) subunits of glutenin and from &gamma-gliadins. Z Lebensm Unters Forsch 196:339-247
Köhler P, Belitz H-D, Wieser H (1993) Disulphide Bonds in Wheat Gluten. In: Gluten proteins 1993 (Association of Cereal Research, Hrsg), Detmold, Germany, S. 79-89
Köhler P, Keck B, Müller S, Wieser H (1994) Disulphide Bonds in Wheat Gluten. In: Wheat Kernel Proteins (Universita Degli Studi Della Tuscia, Consiglio Nazionale Della Richerche, Hrsg), Viterbo, Italia, S. 45-53
Keck B, Köhler P, Wieser H (1995) Disulphide bonds in wheat gluten: cystine peptides derived from gluten proteins following peptic and thermolytic digestion. Z Lebensm Unters Forsch 200:432-439
Müller S, Wieser H (1995) The location of disulphide bonds in α-type gliadins. J Cereal Sci 22:21-27
Wieser H, Müller S (1996) Disulphide bonds of wheat gliadins. In: Gluten'96. Proceedings of the 6th International Gluten Workshop (Wrigley CW, ed) RACI, North Melbourne, Australien, pp 169-172
Köhler P, Keck-Gassenmeier B, Wieser H, Kasarda DD (1997) Molecular Modeling of the N-terminal Regions of High Molecular Weight Glutenin Subunits 7 and 5 in Relation to Intramolecular Disulphide Bond Formation. Cereal Chem 74:154-158
Müller S, Wieser H (1997) The location of disulphide bonds in monomeric γ-type gliadins. J Cereal Sci 26:169-176
Müller S, Vensel WH, Kasarda DD, Köhler P, Wieser H (1998) Disulphide bonds of adjacent cysteine residues in low molecular weight subunits of wheat glutenin. J Cereal Sci 27: 109-116
Müller S, Wieser H, Popineau Y (1998) Disulphide bonds of γ46-gliadin. J Cereal Sci 27:23-25

^b AiF-Forschungsvorhaben Nr. 8684

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